Post by alamin4470 on Aug 13, 2023 5:40:30 GMT -5
商业菌株）作为 LDC 的来源。参考文献 8 详细介绍了用于猪 LDC 的产生。根据制造商的说明(Invitrogen)使用Neon转染系统。通过胰蛋白酶消化收获的LDC用不含钙和镁的DPBS (Invitrogen)洗涤。1×10 6将细胞悬浮于含有 2 μg 每种 CMAH-ZFN 质粒的 120 μl 重悬缓冲液（Invitrogen）中。pEGFP-N1（Clontech，山景城，加利福尼亚州，美国）用作对照来测量转染效率。将细胞在 1300 V、30 ms、1 个脉冲下电穿孔，转移到不含抗生素的 SCM 中，并铺板到胶原蛋白 I 包被的板上。将细胞用5%CO 2和10%O 2在30℃下培养3天并在37℃下培养2天。 筛选CMAH突变细
供比较。浅蓝色框突出显示锌指核酸酶 (ZFN) 的 DNA 结合电话号码列表表位点。(C) 从双 KO 胎儿、GGTA1-KO 胎儿、6 个月大的野生型猪和成年人中收集红细胞 (RBC)。收集的红细胞 (RBC) 用荧光标记的 IB4 凝集素（红色）染色以测量 Gal 表位的水平，或用识别 Neu5Gc 的抗体（青色）染色。未染色的红细胞 (RBC) 用作 IB4 凝集素染色
的阴性对照，并使用同种型匹配的对照进行 Neu5Gc 染色。尽管包含在内，但由于与实验组显着重叠，一些阴性对照直方图很难看到。 对从双敲除胎儿和成人红细胞中收集的红细胞进行流式细胞术验证，功能性 GGTA1 和 CMAH 基因的缺失消除了细胞上的 Gal 和 Neu5Gc 修饰（图 2 C ）。使用来自 6 个月大的野生型和胎儿 GGTA1-KO 猪的红细胞进行比较。尽管资源限制阻碍了比较组的年龄